Masolino nació en una aldea de la Toscana llamada Panicale, pero lo que no se ha establecido es si se trataba de Panicale di Val d'Elsa, como afirma Giorgio Vasari ("Le vite de’ piu eccellenti pittori, scultori, et architettori"), o Panicale en las afueras del lugar de nacimiento de Masaccio, San Giovanni Val d'Arno. Miklós Boskovits, autor principal de "Pinturas italianas del siglo XV. El Catálogo Sistemático de la Galería Nacional de Arte", afirma que el lugar de nacimiento de Masolino fue probablemente la aldea de Panicale ubicada en el Val d'Arno. Se desconoce la fecha exacta de su nacimiento, pero a partir de los documentos se puede deducir una fecha probable de alrededor de 1383 o 1384. En 1422 vivía en Florencia, donde alquiló una casa y un taller. En 1423 se inscribió en el gremio de médicos y farmacéuticos, del que también formaban parte los pintores. En 1428, a la edad de unos cuarenta y cuatro o cuarenta y cinco años, fue liberado de la autoridad de su padre, asumiendo la condición legal de cabeza de familia. Su ciclo de frescos de 1435 en el baptisterio de Castiglione Olona proporciona la última fecha registrada para él.
Según Vasari, la formación de Masolino comenzó en el taller de Ghiberti y continuó a la edad de diecinueve años con Gherardo Starnina. Ambas piezas de información parecen probables; Masolino pudo haber estado asociado con Starnina alrededor de 1402-1403, cuando ese artista, después de su regreso de España, se convirtió en un destacado pintor en Florencia.
Para explicar la falta total de registro de Masolino en las dos primeras décadas del siglo XV, los estudiosos han planteado la hipótesis de la larga ausencia del artista de su ciudad; posiblemente estuvo en Hungría, donde se documenta una estancia entre 1425 y 1427. Una Virgen y el Niño (Palazzo Vecchio, Florencia) y un Busto fragmentario de la Virgen (colección particular, Milán) podrían pertenecer a un período temprano no documentado de actividad en Florencia a principios de la segunda década.
Probablemente fue a finales de 1424 o principios de 1425 cuando Masolino comenzó a colaborar con Masaccio, quien completó su Virgen y Santa Ana (Uffizi, Florencia) y trabajaría con él en la capilla Brancacci en el Carmine, también en Florencia. Parece probable que los dos pintores iniciaran el ciclo a finales de 1424 e interrumpieran definitivamente su trabajo cuando Masolino partió hacia Hungría.
Los documentos prueban que Masolino reapareció en Florencia recién en mayo de 1428, permaneciendo en la ciudad hasta marzo de 1429. Luego fue a Roma, donde pintó el tríptico El milagro de la nieve en Santa Maria Maggiore (cuyos paneles ahora se dividen entre la Galería Nacional, Londres; Museo di Capodimonte, Nápoles; y colección John G. Johnson, Museo de Arte de Filadelfia). En Roma, Masolino también pintó al fresco la capilla de Santa Catalina en San Clemente y ejecutó los frescos (perdidos) que representan a hombres famosos en el Palacio Orsini en Monte Giordano. En 1432 pintó un fresco de la Virgen y el Niño en la iglesia de San Fortunato, Todi.
En 1435, Masolino estaba en Castiglione Olona, cerca de Varese, donde pintó al fresco la Collegiata y el baptisterio a pedido del cardenal Branda Castiglione, quien anteriormente había encargado las pinturas para la capilla de San Clemente en Roma. Los frescos de la Collegiata fueron terminados, presumiblemente después de la muerte de Masolino, por Paolo Schiavo y Vecchietta a fines de la década de 1430.
