Josefa de Óbidos fue bautizada como Josefa de Ayala Figueira, en Sevilla, España, en 1630 - se supone que nació en ese mismo año y lugar. Fue una de los ocho hijos de Baltazar Gomes Figueira, pintor de la villa portuguesa de Óbidos, y de una noble andaluza llamada Catalina de Ayala y Cabrera. Los padres de Óbidos se habían conocido en la década de 1620, mientras Baltazar estudiaba en Sevilla con los artistas Juan del Castillo, Juan de Roelas y Francisco de Zurbarán. Se sabe que su padrino fue Francisco de Herrera el Viejo, ilustre pintor, y en su día maestro de Diego Velázquez, que trabajaba en Sevilla en esa época. Baltazar adoptó un estilo tenebrista característico de la pintura barroca española.
Figueira no tuvo éxito comercial como pintor y fue arrestado por deudas en 1633. La familia se trasladó entonces a Portugal, instalándose en la Quinta da Capeleira, en Óbidos. El historiador Lucas Brandao escribe que «esta marcha no habría tenido lugar sin el patrocinio previo de Francisco de Herrera, fundador de la Escuela de Sevilla, movimiento pictórico que tanta influencia tendría en el desarrollo de la pintura europea occidental». De hecho, se aprecia su influencia en la propia pintura de Josefa, que también adoptó el Barroco y la perfección de sus expresiones como baluarte de su creación». La de Óbidos había mostrado un gran interés por la pintura desde que tenía cuatro años y pasaba muchas horas con su padre en su estudio. Su padre poseía también una impresionante colección de grabados, que padre e hija estudiaban en busca de inspiración artística. A la joven Óbidos le atraía especialmente pintar bodegones de flores y frutas.
Poco después de la restauración de la monarquía portuguesa en 1640, la familia de Óbidos se trasladó a la ciudad ribereña de Coimbra (capital del país de 1139 a 1260). Aprendió a pintar paisajes, naturalezas muertas y obras religiosas. En 1644, mientras su padre se encontraba en la ciudad de Santa Cruz trabajando en el encargo de un retablo para la iglesia de Nossa Senhora da Graça, Óbidos se alojó en el convento agustino de Santa Ana (en Coimbra), donde recibió formación como religiosa (pero sin hacer los votos como tal).
Óbidos, con sólo 16 años, realiza sus primeras obras inscritas -firmadas Josefa Ayala- fechadas en 1646. Realizadas cuando aún residía en el convento, eran grabados de gran calidad de Santa Catalina y San Pedro. En 1647 realizó sus primeras pinturas firmadas, entre las que se cuentan una pequeña obra en cobre de los "Desposorios místicos de Santa Catalina", realizada para el monasterio agustino de Santa Cruz de Coimbra, y una segunda pintura en cobre de un "Nacimiento con San Francisco y Santa Clara adorando a Cristo recién nacido".
Antes de 1653, la artista regresó a Óbidos con su familia. Allí ejecutó una alegoría de la Sabiduría para los Nuevos Estatutos de la Universidad de Coimbra, cuyo frontispicio diseñaba su padre, que ya era un pintor de renombre. Con sólo 23 años, Óbidos aceptó importantes encargos para iglesias y conventos del centro de Portugal: cinco tablas para el retablo de Santa Catalina de la iglesia de Santa María de Óbidos, en 1661; el retablo (ahora separado) de Santa Teresa de Ávila, en el extinto convento carmelita de Cascais, en 1672-1673; y un retablo para la iglesia de la Misericordia de Peniche, en 1679.
Óbidos también recibió encargos de retratos y bodegones de clientes privados, y se convirtió en miembro de la Academia de Arte de Lisboa. Recibió el encargo de realizar un importante grabado en Coimbra, antes de trabajar en algunos de los edificios religiosos más prestigiosos de Portugal, como los grandes monasterios de Alcobaça, Batalha y Évora. También pintó retratos de miembros de la familia real portuguesa. A medida que su reputación crecía, las mujeres de la nobleza, que visitaban las termas cercanas, solían acudir a su estudio. Nunca se casó (y se cree que vivió su vida como una virgen) y se las arregló para vivir cómoda e independientemente de las ganancias de sus pinturas. También fue una astuta mujer de negocios, comprando y arrendando tierras y actuando como prestamista.
Refiriéndose a la publicación del siglo XVIII de Damiao de Froes Perym (seudónimo del monje Fray Joao de San Pedro), "Theatro heroino, abcedario historico, e catalogo das mulheres illustres em armas, letras, acçoens heroicas, e artes liberaes", la crítica Julia K. Dobbs escribe que Óbidos «está justificadamente incluida en el catálogo de mujeres ilustres de Froes Perym, ya que fue, y sigue siendo, la artista más conocida del Portugal del siglo XVII». Añade, sin embargo, que un aspecto «intrigante y algo desconcertante» de la historia de su vida es que «se dice que la artista fue invitada a servir a la Reina en la corte portuguesa [pero] a pesar de las ventajas de tal posición [ella] evidentemente lo rechazó». Dobbs afirma que «cabe preguntarse si la reacción del público y las exigencias de la realeza a Óbidos como “curiosidad” pictórica, señaladas dos veces por el biógrafo, podrían haber sido poco favorables a su naturaleza aparentemente introspectiva».
En la década de 1660, los hermanos de Óbidos, José Ortiz y António, tomaron los votos religiosos. Su hermana Luisa, a la que estaba más unida, y que había estado enferma desde la infancia, murió el 1 de enero de 1664. Según Joaquim Oliveira Caetano, director del Museu Nacional de Arte Antiga de Lisboa, «A partir de entonces, la pintura de Josefa parece haber vuelto a los formatos más pequeños pintados sobre cobre, y a los modelos de bodegones [...] y, sobre todo, a la creación de imágenes estandarizadas del Niño Jesús, el Niño San Juan Bautista y el Cordero Místico». Entre los bodegones más conocidos y originales de Óbidos, «Los Meses», fueron realizados hacia 1668. Revelan la relación humilde (exenta de simbolismo) del artista con los objetos cotidianos. Tras la muerte de su padre, en 1674, se vio obligada a realizar un mayor número de encargos públicos para mantener a su anciana madre y a dos sobrinas huérfanas (con las que vivía desde hacía algunos años en una gran casa que había adquirido en la Rua Direita de Óbidos).
En su testamento, fechado el 13 de junio de 1684, Óbidos es identificada como una «virgen que nunca se casó» y que había sido «emancipada con el consentimiento de sus padres». Falleció el 22 de julio de 1684, a la edad de cincuenta y cuatro años. Fue enterrada en la iglesia de San Pedro de Óbidos. La historiadora de arte Julia K. Dabbs señala que fue enterrada «con el hábito de clarisa, lo que indica que pudo ser miembro laico de la orden franciscana».