Maso (Tommaso) di ser Giovanni di Simone (Mone) Cassai, conocido como Masaccio, nació en Castel San Giovanni (actual San Giovanni Valdarno) el 21 de diciembre de 1401, festividad de Santo Tomás Apóstol, hijo de ser Giovanni di Mone Cassai, notario, y de Jacopa di Martinozzo. Ambos vivían en la casa, aún existente en San Giovanni, de su abuelo paterno Simone, que era un próspero artesano constructor de arquetas de madera (de ahí el apellido "Cassai") para uso doméstico y comercial. Su padre debió de animarle desde muy joven a ser notario, haciéndole estudiar latín y procedimiento jurídico, si ya a los veinte años, edad mínima para ejercer la profesión, se sacó el título de notario.
En 1406, su padre murió repentinamente, con sólo veintisiete años, y poco después su esposa dio a luz a un segundo hijo, llamado Giovanni en honor a su difunto padre, que más tarde se llamó lo Scheggia y que también emprendió una carrera como pintor. Unos años más tarde, Jacopa contrajo segundas nupcias con Tedesco di Mastro Feo, un rico boticario que también era viudo y tenía dos hijas. El 17 de agosto de 1417 muere Tedesco di Mastro Feo y Masaccio se convierte en cabeza de familia.
En cuanto a su formación, según Berti (1989) se formó "probablemente en el taller floreciente y bastante modernista de Bicci di Lorenzo"; mientras que Boskovits (2001) piensa en su cuñado Mariotto di Cristofano y Padoa Rizzo (2001) en el poco conocido Niccolò di ser Lapo. Todas ellas son hipótesis que por el momento, a falta de documentos ciertos, siguen siendo tales.
Ugo Procacci descubrió documentos que prueban que la madre de Masaccio alquiló en aquellos años algunas habitaciones a una tal Piera de' Bardi en la zona de San Niccolò, donde probablemente Masaccio pudo alojarse, quizá en el taller de su cuñado. También es probable que Masaccio se desplazara a menudo a Castel San Giovanni para velar por los intereses de su madre en la disputada sucesión de su padrastro.
Se estima que la llegada de Masaccio a Florencia se remonta a 1418, cuando la ciudad se hallaba en pleno periodo de prosperidad económica, social y cultural. En las primeras décadas del siglo XV, sin embargo, la pintura estaba, como antes de Giotto, muy por detrás de los logros contemporáneos de la escultura y la arquitectura. La falta de modelos directos de la Antigüedad hacía imposible una comparación directa con el arte clásico, y mientras la imitación de los modos de Giotto se hacía cada vez más repetitiva y estéril, la novedad residía en el Gótico Internacional. Gracias a autores como Gherardo Starnina y Lorenzo Monaco, este estilo, basado en una estilización refinada y en un realce naturalista de gestos y expresiones, se extendió y cubrió la creciente demanda, sobre todo privada, de retablos, frescos y obras para la devoción privada. Raros fueron, sin embargo, los grandes ciclos de frescos en iglesias públicas en aquellas décadas, aparte de algunos encargos para capillas familiares.
El aprendizaje de Masaccio bajo Masolino (que era casi veinte años mayor que él), relatado por Vasari en la edición de las Vidas de 1568, es hoy una hipótesis puesta en duda por la crítica, debido a los resultados demasiado diferentes de las obras de ambos antes del comienzo de su asociación (c. 1423-1424).
En 1421, su hermano menor Giovanni también se unió a Masaccio en Florencia y se inscribió como recadero y aprendiz en el taller de Bicci di Lorenzo, el más activo de Florencia en aquella época. La vocación artística de Giovanni era reciente, ya que se había alistado como soldado en 1420, a la edad de catorce años. Algunos han especulado que Masaccio también había trabajado bajo la dirección de Bicci di Lorenzo, pero de nuevo los datos estilísticos contradicen esta hipótesis.
El 7 de enero de 1422, Masaccio se inscribe en el Arte dei Medici e Speziali (Gremio de Médicos y Boticarios), registrando como domicilio el pueblo de San Niccolò. Al inscribirse en el Arte demostró tal confianza en sus capacidades profesionales que pudo hacer frente a las periódicas y nada despreciables cuotas exigidas por el gremio. Otros pintores, por esa razón, pospusieron la inscripción hasta más tarde, como quizá hizo el propio Masolino, que no se inscribió hasta 1423.
Boskovits señaló cómo entre 1420 y 1440 muchos pintores florentinos se fueron liberando de los adornos góticos. Esta tendencia, impulsada quizá por un renacido orgullo cívico florentino, que él denominó "Renacimiento giottesco", tuvo también a Masaccio entre sus exponentes: en su caso, la reinterpretación de Giotto se movió de forma autónoma y más rigurosa que en otros autores, con el injerto fundamental de nuevas condiciones derivadas de otras disciplinas. Entre los mejores ejemplos que Masaccio tuvo a su disposición se encuentran el retablo del Maestro di Figline en la colegiata de Santa Maria in Figline Valdarno, o el políptico de la Coronación de la Virgen de Giovanni del Biondo en la iglesia de San Lorenzo in San Giovanni Valdarno.
El creciente prestigio de Masaccio alcanzó su punto álgido en 1425, cuando se unió a Masolino para pintar una serie de frescos destinados a decorar la capilla Brancacci de la iglesia de Santa María del Carmine de Florencia. Estos frescos monumentales serían algunos de los más importantes de su carrera, con escenas de la Biblia que pintó para acompañar a las realizadas por Masolino. Cuando Masolino viajó a Hungría ese mismo año, la decoración quedó en manos de Masaccio. Masaccio continuó trabajando en ella durante algún tiempo, e incluso regresó a la capilla mientras trabajaba en otros encargos. Durante este tiempo, Masaccio comenzó a recibir otros prestigiosos encargos, entre los que destaca el fresco de la iglesia de Santa Maria Novella.
Masaccio viajó a Roma en 1428, donde murió en la segunda mitad del año, con sólo 26 años. Las circunstancias de su muerte siguen siendo misteriosas. Según una versión bastante dramática, fue envenenado por un artista rival (lo que no es imposible dada la intensa competitividad del mundo del arte en aquella época), aunque muchos creen ahora que murió de peste. En cualquier caso, como dijo Brunelleschi, con la muerte de Masaccio "hemos tenido una gran pérdida".