Se conocen muy pocos detalles biográficos de la vida de Giotto di Bondone. Se cree que era hijo de un campesino, nacido en el Mugello, una zona montañosa al norte de Florencia, que era también la patria de la familia Médicis, que más tarde llegaría al poder en la ciudad. El escritor y artista Giorgio Vasari atribuyó el lugar de nacimiento de Giotto a una casa del pequeño pueblo de Vicchio, y en su influyente obra de 1550, "Vidas de los más excelentes pintores, escultores y arquitectos", le atribuyó la fecha de 1277. Sin embargo, otras fuentes sugieren que nació en 1267, lo que parece más probable a juzgar por la madurez de algunas de sus primeras obras.
El consumado escultor Lorenzo Ghiberti (cuyos logros en la escultura del Renacimiento temprano estaban en deuda con Giotto) cuenta una historia legendaria en su obra escrita en 1452 "Comentarios sobre los artistas toscanos del Trecento". Cuenta que el joven Giotto estaba cuidando ovejas cuando era niño y acertó a pasar por allí Cimabue, quien, impresionado por el talento natural de Giotto —que había dibujado una oveja tridimensional, tan natural y perfecta que parecía viva—, le acompañó hasta su cabaña y consiguió convencer al padre de que le dejara hacer del muchacho su aprendiz.
Giorgio Vasari refiere también, que Giotto era un aprendiz divertido y bromista, a tal punto que en una ocasión pintó una mosca en la nariz de un retrato. Su técnica era tal que Cimabue intentó espantarla con la mano antes de darse cuenta de que estaba pintada. Esta anécdota de juventud presagia ya la técnica característica de Giotto, que le capacitaba para pintar figuras casi reales.
Sea cual fuere el verdadero inicio de su relación profesional, parece probable que Giotto fuera aprendiz de Cimabue, probablemente desde la edad de unos 10 años, donde aprendió el arte de la pintura. Se cree que Giotto viajó a Roma con el artista mayor antes de acompañarle a Asís, donde Cimabue había recibido el encargo de decorar la parte inferior de las dos iglesias recientemente construidas una sobre otra para conmemorar a San Francisco.
Hacia 1290, Giotto se casó con una florentina llamada Ricevuta di Lapo del Pela -más conocida como «Ciuta»-, con la que tuvo varios hijos. (Existe una historia, muy probablemente infundada, según la cual alguien preguntó una vez a Giotto cómo podía crear cuadros tan bellos pero tener hijos tan feos, a lo que él respondió que hacía a sus hijos en la oscuridad). Al mismo tiempo que se casaba con Ciuta, Cimabue abandonó Asís por otro encargo y Giotto se hizo cargo de su trabajo y recibió el encargo de crear un ciclo de frescos para la mitad superior de los muros de la iglesia superior. Aunque Cimabue fue el maestro de Giotto, el alumno pronto usurpó a su maestro, y su habilidad fue reconocida en vida por contemporáneos como el poeta Dante Alighieri, que escribió en su Divina Comedia: «Oh gloria vacía de los poderes humanos...». En pintura Cimabue creía tener el campo ganado, y ahora Giotto tiene el grito, de modo que la fama del otro se ve disminuida.»
Entre 1290 y 1295, aproximadamente, Giotto emprendió su primera gran obra en Asís, en la que realizó una serie de importantes avances pictóricos. Su trabajo fue un éxito, y se le encargó otro ciclo de frescos para la iglesia. Tras una estancia relativamente prolongada en Asís, Giotto inició un periodo de frecuentes viajes por las ciudades-estado de Italia, una pauta que caracterizaría toda su carrera. Giotto estableció talleres en diferentes lugares, donde su estilo fue emulado y donde muchos de sus ayudantes emprendieron sus propias carreras.
A principios de siglo, Giotto viajó a Florencia, Rímini y posiblemente Roma. Después pasó unos tres años en Padua trabajando en una de sus obras más completas y conocidas, la Capilla de la Arena. Durante su estancia en Padua, Giotto pudo conocer al poeta Dante, que se había exiliado allí desde Florencia. En la década comprendida entre 1305 y 1315, Giotto parece haber viajado varias veces entre Florencia y Roma. Trabajó en encargos para algunas de las iglesias más importantes, como la de San Pedro de Roma (la iglesia que precedió a la actual basílica), donde el cardenal romano Jacopo Stefaneschi le encargó dos obras: El único mosaico conocido de Giotto (hacia 1310) y un gran retablo políptico (hacia 1313).
A principios del siglo XIV, la sede del papado no estaba en Roma, sino en Aviñón (Francia). Los cardenales de Roma luchaban por que el papado volviera a su ciudad y encargaron a Giotto obras como un mosaico para la fachada de la antigua basílica de San Pedro (de la que sólo quedan fragmentos), la iglesia papal más importante de Roma. El cardenal Stefaneschi expresó su confianza en que el Papa acabaría regresando y se propuso elevar la importancia espiritual de su sede romana. Se cree, por tanto, que Stefaneschi encargó a Giotto -que ya era un pintor de considerable renombre profesional- como parte de su estrategia política.
Durante este periodo, Giotto también recibió importantes encargos para la iglesia de Santa Croce de Florencia. En torno a 1313, trabajó en una capilla dedicada a los Peruzzi, una rica e influyente familia de banqueros, en la que realizó dos ciclos de frescos que representaban a Juan el Evangelista y a Juan el Bautista. El miembro de la familia Peruzzi que encargó la obra se llamaba «Giovanni» o «Juan», y parece que los frescos pretendían establecer un vínculo entre la familia, la ciudad de Florencia y los santos patronos a los que rendían culto.
La Capilla Peruzzi fue muy admirada por los pintores renacentistas. De hecho, se sabe que Miguel Ángel estudió los frescos que ejemplificaban la habilidad de Giotto en el claroscuro y su capacidad para representar con precisión la perspectiva de los edificios antiguos. También se sabe que las composiciones de Giotto influyeron posteriormente en el trabajo de Masaccio en la Cappella Brancacci. Según los registros financieros que se conservan, entre 1314 y 1327 Giotto pintó también el famoso retablo de la Madonna Ognissanti, hoy en los Uffizi (donde se expone junto a la Madonna Santa Trinita de Cimabue y la Madonna Rucellai de Duccio). Aunque Giotto se instaló durante un tiempo en Florencia, se sabe que regresó a Asís entre 1316 y 1320, donde trabajó en la decoración de la iglesia baja (dejada inacabada por su antiguo maestro Cimabue). De regreso a Roma en 1320, Giotto completó el Tríptico Stefaneschi (hoy conservado en el Museo Vaticano) para el cardenal Jacopo, quien también le encargó la decoración del ábside de San Pedro (los frescos fueron destruidos durante la renovación del siglo XVI).
En 1328, Roberto de Anjou, rey de Nápoles, llamó a Giotto a su corte. Es posible que fuera recomendado a Roberto de Anjou por la familia Bardi, para la que había realizado recientemente una serie de frescos para la capilla familiar de la iglesia de Santa Croce. En Nápoles, mientras tanto, Giotto se convirtió en pintor de la corte, lo que significó que abandonó el estilo de vida itinerante más precario que había caracterizado hasta entonces su carrera. Recibió un salario y un estipendio para materiales y asistencia, y en 1330 Roberto de Anjou le nombró «familiaris», lo que significaba que había pasado a formar parte de la casa real. Lamentablemente, no se conserva casi nada de este periodo. Un fragmento de un fresco que representa la Lamentación de Cristo en la iglesia de Santa Chiara lleva su marca, al igual que el grupo de Hombres Ilustres que adornan las ventanas de la capilla de Santa Bárbara de Castel Nuovo, aunque los historiadores suelen atribuir estas obras a alumnos de Giotto.
Tras su estancia en Nápoles, Giotto permaneció brevemente en Bolonia, donde pintó un políptico para la iglesia de Santa Maria degli Angeli y, según se cree, una decoración perdida para la capilla del castillo del cardenal legado. En 1334, Giotto regresó de nuevo a Florencia. Aquí fue nombrado «capomaestro» o maestro de obras municipales y jefe del gremio de albañiles de la catedral. Supervisó las obras de arte para la construcción de la catedral de Florencia, mientras que su propia contribución fue un diseño para un campanario (aunque sólo la parte inferior se construyó según sus estipulaciones). La nueva iglesia, cuyas obras se iniciaron a finales del siglo XIII, se inspiró en la iglesia de Santa Reparata, del siglo VII, y no se terminaría hasta pasados 200 años. Como muestra de la estima que se le tenía, Giotto fue enterrado en Santa Reparata a expensas de la ciudad tras su muerte el 8 de enero de 1337.