Nicolas Poussin nació cerca de la ciudad de Les Andelys, en Normandía, en 1594. Era hijo de una familia noble venida a menos. Fue escolarizado en muchas asignaturas, entre ellas latín y letras, pero mostró talento para el dibujo (al parecer, sus maestros le reñían por hacer garabatos en sus libros). El pintor barroco francés Quentin Varin conoció su obra al pasar por la ciudad de Poussin y le animó a dedicarse profesionalmente a la pintura. Sus padres, sin embargo, no estuvieron de acuerdo, lo que llevó al joven Poussin a huir a París en 1612, con sólo 18 años.
A su llegada a París estudió muchos temas, entre ellos anatomía y perspectiva visual, mientras trabajaba con pintores más establecidos como Georges Lalleman y Ferdinand Elle. El comercio del arte florecía en aquella época, y personajes como la reina de Francia, María de Médicis, le hacían numerosos encargos para decorar su palacio, mientras que los ricos propietarios de tierras buscaban obras religiosas originales para decorar sus casas. Sin embargo, Poussin seguía en la periferia y no le gustaba el sistema de talleres, que exigía que varias personas trabajaran en la misma obra. Fue en París donde conoció por primera vez el arte renacentista italiano, un estilo que determinaría su propio destino artístico.
En la década de 1620, su carrera había comenzado a repuntar. En 1622, recibió su primer encargo para los jesuitas, y al año siguiente se le pidió que realizara un cuadro para colgar en Notre-Dame. Las pinturas para los jesuitas hicieron que Poussin se diera a conocer en los círculos artísticos, y a través de ellas fue contratado por el poeta de la corte Giambattista Marino para realizar una serie de dibujos. Este influyente encargo dio lugar a otros, y cuando Marino viajó a Roma en 1623, pidió al joven pintor que le acompañara.
Poussin llegó a Roma en 1624, donde permanecería (sin perjuicio de una breve excursión a París) hasta su muerte en 1665. Sin embargo, su amigo y mecenas Marino murió poco después de su llegada, lo que dejó a Poussin en dificultades económicas. También se vio afectado por la sífilis, de la que nunca se recuperaría del todo. A pesar de estos primeros contratiempos, Poussin estudió en la academia del artista italiano Domenichino, aprendiendo a pintar desnudos y visitando catedrales y conventos para estudiar la obra de los maestros italianos. Su primera obra maestra, "La muerte de Germánico", le llegó poco después, en 1627. También recibió su único encargo del Vaticano para pintar "El martirio de san Erasmo". Por aquel entonces conoció a Cassiano dal Pozzo, que se convertiría en uno de sus mecenas más influyentes y en un gran amigo personal. Dal Pozzo ayudó a Poussin a conseguir otros encargos y a consolidar su posición como pintor importante en Roma. Dal Pozzo también introdujo a Poussin en la literatura, la filosofía y la historia del arte. Esto le inculcó un amor por el aprendizaje y las ideas que se convertiría en la base de su obra cada vez más compleja.
Poussin también conoció a otro francés italianizado, Claude Lorrain (a veces más conocido simplemente como Claude). Ambos eran vecinos íntimos y, de hecho, el cardenal Camillo Massimo, neoestoicista (una combinación de cristianismo y estoicismo clásico), los patrocinaba. Poussin y Claude se embarcaban juntos en expediciones de dibujo a la Campagna, donde dibujaban (o pintaban, en el caso de Claude) el heroico paisaje romano. Claude ya se había labrado una reputación como maestro de la pintura de paisaje y se admite generalmente que Claude, que trabajaba con un mayor sentido de la espontaneidad que su compatriota, más cerebral, contribuyó a abrir los ojos de Poussin a la belleza celestial de la naturaleza. Poussin conoció también de cerca al poeta barroco Giovanni Battista Marino, al grabador y dibujante Pietro Testa (con quien compartió su interés por la historia antigua) y al polímata (escritor, pintor, matemático y sacerdote) Matteo Zaccolini, considerado un especialista en perspectiva.
En 1630, Poussin se casa con Anne-Marie Dughet. En 1632, ya había ganado lo suficiente para comprarles una pequeña casa en la Via Paolina. Fue un periodo de gran productividad para el pintor, a pesar de que siempre trabajó solo y nunca había establecido su propio estudio. En esa misma época, se aventuró en la pintura de paisaje, un género que no tenía la misma herencia ni la misma seriedad que las narraciones bíblicas y mitológicas sobre las que había construido su reputación. De hecho, la incursión de Poussin en el paisaje sería fundamental para el desarrollo del género. Se inspiraba en sus viajes a la campiña romana, aunque seguía tratándola como telón de fondo de historias literarias establecidas. Muchas de sus obras más famosas -como El rapto de las Sabinas (1633-34) y Danza al son del tiempo (1636)- las realizó durante este periodo. Sin embargo, la nueva fama de Poussin le llevó a rehuir la vida pública, y prefirió trabajar en encargos de coleccionistas privados antes que en proyectos estatales y/o eclesiásticos.
Las noticias de la creciente reputación de Poussin se extendieron por todo el continente y recibió encargos de varios miembros de la alta sociedad parisina. Por ejemplo, el cardenal Richelieu le encargó dos cuadros distintos, El triunfo de Pan y El triunfo de Baco (para colgarlos en su casa y no en una iglesia). En 1639 recibió una invitación para trasladarse a París y trabajar para el rey Luis XIII, aunque se resistía a abandonar Roma. Por orden del rey, Poussin partió de Italia hacia Francia, donde llegó en diciembre de 1640. Nombrado primer pintor del rey, sus principales tareas fueron decorar la residencia real, realizar los diseños de la Galería Larga del Louvre y pintar retablos para el rey y los miembros de su corte. Trabajando con un gran equipo de ayudantes, Poussin se sintió frustrado por su falta de autonomía y la peculiar mezcla de exigencias del Rey. Poussin consiguió finalmente organizar su regreso a Italia en 1642. De hecho, la muerte de Richelieu en diciembre de ese año, y la del propio rey sólo cuatro meses después, significaron que Poussin quedaba absuelto de cualquier obligación futura de regresar a la corte francesa.
A su regreso a Roma, Poussin descubrió que muchos de sus antiguos clientes habían fallecido, aunque se mantenía económicamente gracias a un creciente número de mecenas franceses. A medida que envejecía, Poussin se fue volviendo más solitario y se le conocía por ser bastante cascarrabias e intolerante con otros pintores. Sin embargo, defendió la obra del francés Charles Le Brun, pintor con el que trabajó durante tres años. De hecho, Le Brun ejerció una influencia considerable en la visión del mundo de Poussin, aunque la teoría del arte que ambos desarrollaron resultó algo controvertida. Le Brun, hablando en nombre de su amigo, entró en disputa con el crítico Roger de Piles sobre la nueva actitud de Poussin hacia el color: lo que Le Brun llamó el enfoque "Poussinista". En este enfoque, el color se volvería más tenue -en otras palabras, secundario con respecto al tema en sí- y se podrían encontrar precedentes en la obra de aquellos pintores que seguían los temas de la Antigüedad (como Rafael). De Piles defendía más bien la obra del artista flamenco Peter Paul Rubens, que a su vez había aprendido de las reglas compositivas y cromáticas más expresivas de Tiziano y Correggio. Aunque se creía que los rubenistas habían ganado este debate, la posición contraria de Poussin resonaría en las futuras deliberaciones estéticas de la pintura francesa.
En 1650, la salud de Poussin empieza a declinar. Se calcula que aún pintaba cuatro cuadros al año, pero empezaba a sufrir temblores en las manos. En los años que precedieron a su muerte, Poussin se limitó a pintar paisajes, como Paisajes con Píramo y Tisbe (1651) y la serie de Las cuatro estaciones, realizada entre 1660 y 1664. En esta ambiciosa serie, Poussin utilizó figuras del Antiguo Testamento en cada lienzo para representar estaciones individuales. Especialmente en estas obras, Poussin utilizó su amplitud de miras y su búsqueda de una representación compleja para producir obras ricas en significado cultural y emocional, sin dejar de mostrar la armonía inherente a la naturaleza.
Tras la muerte de su esposa en 1664, la salud de Poussin se deterioró rápidamente y murió en 1665 a la edad de 71 años. En su testamento final especificó que no deseaba un funeral elaborado, lo que reflejaba su interés de toda la vida por la filosofía estoicista. La ciudad de Roma se entristeció por su muerte y se celebró una gran procesión hasta la iglesia de San Lorenzo in Lucia, donde fue enterrado.